一、 什么是组织交叉反应？

组织交叉反应（Tissue Cross-Reactivity, TCR） 研究是针对含有互补决定区（CDR）的抗体和抗体样分子推荐的筛选试验，目的是确认受试抗体与药效靶组织抗原表位的结合，检测抗体是否与非靶部位组织抗原结合，确定非临床安全性试验相关动物种属及为毒性靶器官的预测提供参考 [1 ， 2] 。

二、 抗体类药物发展与TCR研究的应用

单克隆抗体(Monoclonal antibody, mAb) 类药物是当今生物制药研发领域的热点，据统计，2011～2023年，有80多种单克隆抗体药物在美国FDA获批上市。其中人源化单克隆抗体33种，占40.24%；全人源单克隆抗体32种，占39.02%；人鼠嵌合抗体5种，占6.09%；此外还有10种抗体药物偶联物 ( Antibody-drug conjugate, ADC) ，占12.19%和2种双特异性抗体( Bispecific antibody, BsAb) ，占2.44% ^{[ 3 ， 4 ]} 。随着现代生物技术的发展和基础医学的深入研究，抗体药物的应用已涵盖肿瘤、免疫性疾病、病原体感染性疾病、代谢性疾病、遗传性疾病和神经系统疾病等领域 [3] (图1)。

【图1】A. 抗体结构为轻链(L)和重链(H)，具有可变区(VL, VH)和恒定区(CL, CH)，由链间二硫键连接。绿色符号为抗原结合位点。B. 2011-2023年获批上市的单克隆抗体药物。

而抗体类药物作为一种新型的生物技术药物具有特定的免疫性。除了与适应症相关本身特定的靶器官外，如果人体正常组织细胞中存在相同或相似的抗原决定簇，药物则可能会与非靶器官外的其他组织或细胞结合，从而产生严重的副作用。

因此抗体类药物的组织交叉反应试验在药物临床前的安全性评价中非常重要 ^[5，6] ，需要研究者合理设计TCR研究及保证试验操作的规范性，有效控制试验结果的准确性，从而正确判定此类药物是否存在组织交叉反应，帮助非临床安全性试验相关动物种属确定及预测毒性靶器官，为临床用药提供参考。

三、 组织交叉反应试验相关指导原则

截至目前，关于TCR研究国内外发布了多个指导原则 ^{[ 7-11 ]} （表1），对TCR试验的科学性和技术性进行了全面阐述。

【表1】国内外发布的TCR研究相关指导原则

四、 组织交叉反应试验设计要点解析

1

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研究开展时间

FDA及NMPA均要求在I期临床试验开展前，应完成供试品与组织或细胞的交叉反应研究或与非靶组织的结合研究。

2

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试验方法

免疫组织化学技术（Immunocytochemistry, IHC） 是TCR研究的主要方法（图2），FDA及NMPA还支持使用除IHC外的其他方法，例如微量细胞毒性、流式细胞术和/或放射自显影技术等。

【图2】IHC操作图

3

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组织材料

对于TCR研究组织材料的规定上，国内外指导原则存在一些异同之处。

FDA：PTC指南

• 应使用快速冰冻的成人（如果有）和（或）胎儿组织来进行人重要器官、血液成分及预期靶细胞或组织的免疫组化研究；

  
  

• 至少3个无关联的捐献者来源的人体组织；关于死者的一般信息必须收集，包括年龄、性别、民族、病史以及死亡原因。所取组织最好是年龄＞18岁的成年人；

  
  

• 首选手术组织，也可使用尚未自溶的尸检组织；
  
  
• 特殊情况下，可使用代表性的培养细胞系、干细胞及胚胎/胎儿组织；
  
  
• 附录I列出了32种快速冰冻成人组织（图3）
  

【图3】FDA规定的TCR研究人体组织清单

NMPA：《人用单克隆抗体质量控制技术指导原则》

• 可以使用冰冻及石蜡包埋的各种正常脏器组织测定；

  
  

• 来源于肿瘤相关抗原的单克隆抗体应进行与各种肿瘤组织的交叉反应试验。

4

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试验设计

I.组织材料：

TCR研究的组织材料选取需根据申报要求进行个体化设计。依据美国FDA的PTC指南中的表述，组织材料应为手术或者活检的新鲜组织，用恰当的取材、固定及保存方法制备成冰冻切片。正常人体冰冻组织至少要选择3套来自不同个体的捐献者，而非人灵长类动物及啮齿类动物冰冻组织则至少选择2套来自不同的动物个体。NMPA也允许选用石蜡组织样本。

II.染色方法选择：

免疫组织化学染色可分为直接法和间接法。最终采用何种方法取决于最佳的染色和最低的背景染色或非特异性染色，须考虑以下几点∶①供试品的类型。②供试品的亲和力。③临床试验中的血浆浓度。④抗原决定簇的稳定性。⑤能够提高染色技术而使得大部分组织着色。

III.对照组设定：

对照组设定需考虑阳性对照、阴性对照及分析对照三部分。

阳性对照：

阳性一抗对照： 与靶抗原特异结合的一抗，如果是抗体类生物类似药TCR研究，目的包括与参照药（原研产品）比对，建议包括阳性一抗对照参照药；

• 阳性组织对照：靶抗原表达或过表达的组织切片，包括正常组织（自身对照）、肿瘤组织或炎症组织；
• 阳性细胞系对照：表达靶抗原细胞系和/或转染细胞系；
• 阳性成瘤组织：表达靶抗原转染细胞系裸鼠成瘤组织切片。

阴性对照：

• 阴性一抗对照：与一抗或供试品相同种属、相同亚型正常IgG或同型IgG；
• 阴性细胞系对照：无靶抗原表达的细胞系和/或未转染细胞系；
• 阴性组织对照：无靶抗原表达的组织切
  片（自身对照）。

分析对照：

• 分析对照常用磷酸盐缓冲液代替一抗，可帮助分析背景性和/或非特异性染色是由于组织色素或染色方法引起。

IV.组织可接受性

组织可接受性对照是针对人组织普遍存在抗原的抗体，目的是提供用于TCR研究的人组织抗原未降解可用于IHC的证据。常用的抗体包括血小板-内皮细胞粘附分子（Platelet endothelial cell adhesion molecule-1, PECAM-1/CD31)、转铁蛋白受体(Transferrin Receptor, CD71) 及β2微球蛋白。如果某一套人组织与上述组织可接受性抗体IHC无染色，表明该套人组织不适用于TCR研究。

V.试验浓度的设计

在TCR试验中，首先需将标记好的单抗药物梯度稀释后，分别对阳性对照和阴性对照组织进行染色，建立免疫组化方法学参数 ^{[ 12 ]} 。

• 最佳浓度：应选择与阳性组织出现明显结合的最低浓度；需注意最佳浓度的设置不可过低，否则会影响试验敏感性。
• 最高浓度：应选择与阳性组织出现明显结合，但未在阳性对照和阴性对照组织产 生非特异性着色的最高 浓度，这样才能保证试验结果的特异性。

VI.结果判定

在TCR研究中，合理利用和分析阳性及阴性对照组的结果可以在一定程度上解决试验中的“假阳性”和“假阴性” ^{[ 13 ]} ，在排除以上干扰因素后，再从染色强度、分布范围、分布定位、非标记物特异性着色四方面进行结果分析。

对于抗体药物与非靶器官存在的交叉反应，在最终的评估中必须经过多方面考虑，从而为预测药物可能发生的毒性反应提供客观的依据。

VII.其他

针对双特异性抗体是否进行单独亲本检测，不同指导原则做出了不同的要求（表2）。因此，针对双特异抗体的TCR研究的设计，需要从多方面进行综合考量。

【表2】不同指导原则对于双特异性抗体TCR研究的规定

结语

单克隆抗体类药物作为当前生物药研究的热点，需要充分考虑其安全性，组织交叉反应试验在药物临床前的安全性评价中非常重要。 目的是确认受试抗体与药效靶组织抗原表位的结合，检测抗体是否与非靶部位组织抗原结合，帮助非临床安全性试验相关动物种属确定及毒性靶器官的预测。 TCR研究要充分解读国内外指导原则，保证该研究过程的科学性、结果的可靠性，为将来临床用药提供参考。

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参考文献：

[1] 吕建军,张硕,林志,屈哲,霍桂桃,杨艳伟,张頔,汪巨峰,李波.单克隆抗体及基于抗体类药物组织交叉反应研究现状及关注点[J].药物分析杂志,2015,35(12):2061-2069.
[2] Leach MW, Halpern WG, Johnson CW, Rojko JL, MacLachlan TK, Chan CM, Galbreath EJ, Ndifor AM, Blanset DL, Polack E, Cavagnaro JA. Use of tissue cross-reactivity studies in the development of antibody-based biopharmaceuticals: history, experience, methodology, and future directions. Toxicol Pathol. 2010 Dec;38(7):1138-66.
[3] 牟大超,周轶,白秀峰.单克隆抗体技术进展及上市药物分析[J].药物生物技术,2022,29(01):87-94.
[4] 付志浩,徐刚领,黄璟,于传飞,王兰,王军志.单克隆抗体药物研发进展[J].中国药事,2021,35(11):1253-1268.
[5] LiverTox: Clinical and Research Information on Drug-Induced Liver Injury [Internet]. Bethesda (MD): National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases; 2012-. Monoclonal Antibodies. [Updated 2023 Feb 28].
[6] 林志,屈哲,吕建军等.单克隆抗体类药物组织交叉反应常见问题的探讨[J].中国新药杂志,2012,21(14):1600-1602+1606.
[7]U.S.FOOD AND DＲUG ADMINISTＲATION ( FDA) ．Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use［EB /OL］.1997.
[8] ICH S6 (R1). Preclinical Safety Evaluation of Biotechnology-Derived Pharmaceuticals［EB /OL］．2011.
[9] EUROPEAN MEDICINES AGENCY (EMEA ) ．Guideline on Strategies to Identify and Mitigate Risks for First-In-Human Clinical Trials with Investigational Medicinal Products［EB/OL］．2007.
[10] CFDA (国家食品药品监督管理总局) CDE(药品审评中心) ．Guideline on Quality Control Technique of Monoclonal Antibodies for Human Use (人用单克隆抗体质量控制技术指导原则)［EB/OL］. 2008.
[11] CFDA (国家食品药品监督管理总局). Guideline on Research ＆ Development and Evaluation Technique of Biosimilar (on trial) (生物类似药研发与评价技术指导原则(试行) )［EB /OL］.2016.
[12] 祁德波,王新国,富欣等.组织交叉试验中多路径体系技术难点的探索和研究[J].药物评价研究,2017,40(10):1372-1377.
[13] 余珊珊,王海学,胡晓敏等.组织交叉反应试验在非临床安全性评价中的应用及案例分析[J].中国新药杂志,2016,25(06):634-638.